artikel

Analyseren van duizenden druppels

Voedselveiligheid & Kwaliteit

Analyseren van duizenden druppels

Het ILVO ontwikkelt de nieuwe droplet digital PCR. Belangrijk voordeel hiervan ten opzichte van de kwantitatieve PCR is dat een standaardcurve op basis van referentiemateriaal niet nodig is.

Zeker nu monsters gemakkelijker kunnen worden verdeeld in zeer kleine deeltjes of druppeltjes, neemt de populariteit van deze methode toe bij het detecteren van pathogenen en virussen, maar ook voor ggo’s en allergenen.

De polymerase kettingreactie (PCR) werd voor het eerst beschreven in de jaren tachtig. Bij deze techniek wordt een specifiek stukje DNA vermeerderd en gedetecteerd. Kort na deze uitvinding werden de mogelijkheden verkend om met deze techniek ook de hoeveelheid of concentratie van een stukje DNA te bepalen. Deze kwantitatieve PCR (qPCR) is tot op vandaag de dag de meest gebruikte PCR-gebaseerde analyse. De techniek maakte de inschatting mogelijk van het aantal DNA-kopieën, en dus de hoeveelheid van een DNA-doelsequentie, door de vermeerdering in real time te volgen en met intern referentiemateriaal te vergelijken. Deze kwantificatietechniek wordt bijvoorbeeld routinematig toegepast voor het bepalen van de hoeveelheid genetisch gemodificeerde organismen (ggo’s) in levensmiddelen.

Digitale PCR populair

Nog voor de uitvinding van de qPCR was er al een alternatieve PCR-techniek beschreven voor de kwantificatie van DNA, ook wel aangeduid met digitale PCR (dPCR). Digitale PCR werkt onder het motto ‘verdeel en heers’, waarbij het monster in duizenden deeltjes of druppeltjes wordt verdeeld en de PCR in elk van die deeltjes of druppeltjes plaatsvindt. Bij digitale droplet PCR (ddPCR) wordt het monster zo verdeeld over de druppeltjes dat slechts een aantal daarvan het specifieke stukje DNA bezit. Tijdens de PCR zal enkel in deze druppels een vermeerdering plaatsvinden. De verhouding positieve druppels ten opzichte van de totale hoeveelheid druppels maakt absolute kwantificatie mogelijk, zonder gebruik te hoeven maken van een standaardcurve op basis van referentiemateriaal. Dat laatste brengt twee grote voor- delen met zich mee ten opzichte van qPCR.

Allereerst dient referentiemateriaal namelijk gekalibreerd te worden via fluorometrie of fotospectrometrie-technieken die fouten met zich kunnen meebrengen. Verder wordt verondersteld dat het monster en het referentiemateriaal eenzelfde PCR-efficiëntie ondervinden. Dit is echter niet altijd het geval omdat ongekende stalen vaak componenten bevatten met een remmend effect op de PCR. Ondanks de voordelen van digitale PCR, bleef dPCR in het verleden lange tijd op de achtergrond. De reden hiervoor is dat de verdeling van het monster in duizenden deeltjes of druppeltjes vaak onpraktisch en zeer duur bleek. De recente ontwikkeling van de chamber digital PCR (cdPCR) en droplet digital PCR (ddPCR), waarbij het monster respectievelijk in duizenden kamers en druppeltjes kan worden verdeeld, heeft de populariteit van deze techniek opmerkelijk doen toenemen.

Complexe matrices

De meeste voedselmonsters bestaan uit zeer complexe matrices met tal van componenten die een remmend effect kunnen hebben in de PCR, de zogenoemde PCR-inhibitoren. Deze inhibitoren kunnen de PCR-efficiëntie van het onbekende monster danig doen verschillen ten opzichte van het referentiemateriaal, waardoor er een onderschatting is van het aantal organismen. Omdat de meeste pathogenen slechts aanwezig zijn in lage aantallen – 102 tot 104 cellen per gram of vaak nog veel lager – kan dit zelfs leiden tot vals-negatieve resultaten. De dPCR blijkt minder gevoelig te zijn voor deze remmende effecten omdat de vermeerdering van de DNA- fragmenten niet in real time wordt gemeten, maar enkel na afl oop van de PCR wordt bepaald.

Accurate ggo-kwantificatie

Sinds de jaren negentig staan tal van landen, inclusief de EU-landen, het gebruik van bepaalde ggo’s toe in de voeding van mens en dier. Binnen de EU moet het gebruik van de toegelaten ggo’s vermeld worden op het etiket van het product, tenzij de concentratie van het ggo-ingrediënt onder een bepaalde drempelwaarde valt (0,9%). Om een degelijke ondersteuning van dit beleid te garanderen, is een accurate kwantificatie van ggo’s in levensmiddelen en dierenvoeder essen tieel. De meeste routinelabs gebruiken daarvoor de populaire qPCR. Voor accurate kwantificatie is echter gecertifi ceerd referentiemateriaal nodig. De aanmaak hiervan is vaak complex, tijd- rovend en duur. Bovendien kan de genetische achtergrond – en bijgevolg het exact aantal kopieën van een specifieke DNA- doelsequentie die uniek is voor de ggo-lijn en opgespoord wordt in de qPCR – van het referentiemateriaal verschillen met die van het ongekende monster. Dit leidt tot inaccurate kwantifi cering van het ggo-gehalte en zodoende foutieve interpre tatie van de resultaten en beoordeling van voedingsmonsters. Daarom is dPCR een veelbelovende techniek voor ggo-kwantificatie in de toekomst, met de mogelijkheid tot absolute kwantifi catie onafhankelijk van dit gecertificeerd referentiemateriaal.

Detecteren voedselallergenen

Voedselallergenen vormen eveneens een belangrijk risico voor een groep van consumenten. Twee tot vier procent van de wereldbevolking kan namelijk een allergische reactie ondervinden bij opname van zeer kleine hoeveelheden allergenen. Detectie kan hier gebeuren op twee niveaus. In de eerste plaats door de detectie van eiwitten of deeltjes ervan die uniek voorkomen in het voedingsingrediënt dat allergie kan opwekken. In de tweede plaats kan de detectie gebaseerd zijn op het opsporen van een DNA-fragment dat uniek is voor het ingrediënt. Dat zou het gen kunnen zijn dat codeert voor het allergene eiwit. Terwijl de routinematige detectie nog vaak gebaseerd is op eiwitniveau, zijn deze methodes vaak onderhevig aan grote variabiliteit en lagere specifi citeit ten op zichte van de DNA-gebaseerde methode. In tegenstelling tot de ggo-detectie is er bij de voedselallergenendetectie behoefte aan internationale harmonisatie. Bovendien is er een gebrek aan gestandaardiseerd referentiemateriaal. In de zoektocht naar een gevalideerde detectiemethode voor voedselallergenen zou de dPCR een waardevolle kandidaat kunnen zijn, met zijn hoge gevoeligheid en robuust karakter voor PCR-inhibitie.

Reageer op dit artikel