artikel

Biofilms gerichter te lijf gaan

Algemeen

Biofilms gerichter te lijf gaan

Bij Belgische voedingsmiddelenbedrijven werd op 0 tot 33 procent van de bemonsterde plaatsen biofilms aangetroffen met soms aantallen tot meer dan een miljoen bacteriën per 100 vierkante centimeter. Een grondige karakterisering gaf de bedrijven beter inzicht in het probleem. Vervolgens werd een nieuwe detectiemethode getest, evenals reinigings- en desinfectieproducten en methodes. Zodoende kunnen bedrijven biofilms nog gerichter aanpakken. Dit artikel is verschenen in VMT 2 van 16 februari 2018.

Belgische voedingsbedrijven genieten wereldwijd een sterke reputatie voor wat betreft kwaliteit en voedselveiligheid. Die zouden ze niet hebben behaald zonder een efficiënt reinigings- en desinfectiebeleid. Toch blijkt uit onderzoek met de sector dat persisterende besmettingen een aandachtspunt blijven. Oorzaak zijn vaak biofilms die zeer moeilijk zijn te verwijderen. Eigenlijk was er nog steeds weinig bekend over het fenomeen biofilms in de levensmiddelenindustrie, de manier waarop ze kunnen worden bemonsterd en opgespoord, welke bacteriën ze bevatten en wat de chemische samenstelling van de beschermende laag is. Daarop heeft het Killfilm-onderzoeksproject zich gericht.

Opsporen van biofilms

In het Killfilm-project is een biofilm in praktijkomstandigheden gedefi nieerd als: een biofilm bestaat uit micro- organismes die na reiniging en ontsmetting nog steeds vastgehecht zijn aan een oppervlak en daar een matrix vormen, de extra cellulaire polymere substantie of EPS-laag. In een eerste stap gingen onderzoekers van het Instituut voor Landbouw-, Visserij- en Voedingsonderzoek (ILVO) en Universiteit Gent na hoe biofilms in de deelnemende levensmiddelenbedrijven kunnen worden gedetecteerd en bemonsterd. Om een complete, eenduidige identificatie te garanderen, dienen er verschillende methodes gecombineerd te worden. In veel voedingsbedrijven worden al ATP- of NAD-metingen gebruikt voor de evaluatie van de reinigings- en ontsmettingsprocedure. Beide methodes geven een indicatie van het aantal levende cellen – zowel microbiële als plantaardige en dierlijke cellen – die aanwezig zijn op een oppervlak, en dus niet enkel van bacteriën. Ook kan de aanwezigheid van de EPS-matrix hiermee niet worden aangetoond. Anderzijds kunnen eiwitten worden opgespoord die een indicatie zijn van mogelijk aanwezige biofilms. Ook de micro-organismes van de biofilm zelf kunnen worden opgespoord als indicatie voor de aanwezigheid van biofilms. Zo zijn er testkits op de markt die slijmvormende bacteriën in een monster opsporen.

Nieuwe detectiemethode

Aangezien al deze methodes slechts één facet van biofilms kunnen detecteren, be sloten de onderzoekers samen met de levensmiddelenbedrijven in het project een eigen methode te ontwikkelen. Het gaat om een combinatie gebaseerd op het opsporen van bacteriën enerzijds en chemische componenten van de EPS anderzijds. De methode bestaat uit een bemonstering met behulp van een celschraper, gevolgd door het swabben met een floqswab. Op dit monster worden dan klassieke microbiologische analyses uitgevoerd en chemische spectrofotometrische analyses. Alleen al de keuze van het materiaal van de gekozen schraper en floqswab bleek zeer belangrijk, gezien de interferentie met de chemische componenten van de EPS. Zo zorgt bijvoorbeeld het gebruik van een cellulose sponsstick voor een chemische interferentie. Om de biofilm in levensmiddelenbedrijven in kaart te brengen, werden dus met de eigen ontwikkelde methode – na reiniging en desinfectie – allerlei types contactoppervlakken bemonsterd, waaronder transportbanden, inoxleidingen, binnenkant van ketels, messen, vormen en mengers. Wanneer die oppervlakken naast bacteriën in een voldoende hoeveelheid ook suiker, eiwitten en uronzuren – afkomstig uit de EPS-laag – bevatten, werd het oppervlak beschouwd als biofilm bevattend.

Bemonstering bij bedrijven

In totaal werden acht levensmiddelenbedrijven uit diverse sectoren bemonsterd: zuivelbedrijven, vleesverwerkende bedrijven, een sausenproducent, een eiverwerkend bedrijf en een producent van ovenhapjes. Op 17 procent van de in totaal 174 bemonsterde punten werden na reiniging en ontsmetting nog biofilms aangetroffen, variërend van 0 tot 33 procent op bedrijfsniveau. De microbiologische belasting lag in de orde van >2 tot 7 log bacteriën per 100 cm2 . Als chemische component werden vooral eiwitten aangetroffen in de biofilm. De biofilms waren niet erg persistent; plaatsen die bij een eerste bemonstering positief waren, bleken dat bij een tweede bemonstering niet meer te zijn. Dit toont aan dat de bedrijven niet geconfronteerd werden met hardnekkige biofilms.

Grondige karakterisering

Vervolgens werden de ontdekte biofilms zowel microbiologisch als chemisch gekarakteriseerd. De microbiologische karakterisering gaf inzicht in de sectorspecifieke microbiële gemeenschap, aanwezig in de biofilms en de wijziging in samenstelling ervan in functie van de tijd. Ook werd duidelijk welke micro-organismes de biofilm domineren en aan de basis liggen voor mogelijke contaminatie of bederfproblemen in de geproduceerde levensmiddelen. De microbiële populatie was vaak zeer divers en bleek uiteindelijk ook niet echt sectorspecifiek. De meest voorkomende organismes waren Pseudomonas spp. (20%), Microbacterium spp. (12%) en Stenotrophomonas spp. (9%). In enkele bedrijven werden ook persisterende dominante organismes aangetroffen in de biofilm, zoals Stenotrophomonas maltophilia, Lactobacillus paraplantarum, Pseudomonas gessardii en Pseudomonas hunanensis.

Biofilmvormend vermogen

Met behulp van diverse modelsystemen werd tevens het biofilmvormend vermogen van de verschillende geïsoleerde bacteriën onderzocht onder gecontroleerde omstandigheden. In alle deelnemende bedrijven werden een of meerdere bacteriële genera gevonden met zeer sterke biofilmvormende eigenschappen. Van alle aangetroffen bacteriën zijn gemiddeld 35 procent sterke biofilmvormers, die voor meer dan de helft (54%) behoren tot vier genera van bacteriën, zijnde Pseudomonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter en Microbacterium. Ook was het opvallend dat er binnen eenzelfde bacterieel species stamverschillen zijn. Zo zijn er Microbacterium flavum-stammen die zeer goed biofilms kunnen vormen en andere Microbacterium flavum-stammen die daartoe slechts matig in staat zijn. 86 procent van de zeer sterke biofilmvormers hadden bovendien een bederfpotentieel voor eiwit-, vet-, zetmeelafbraak, glucosefermentatie of andere afbraakeigenschappen met potentieel nadelige gevolgen voor de bedrijven. Het zijn deze micro-organismes die extra in het oog moeten worden gehouden. Het was echter niet evident om een link te kunnen leggen tussen bacteriën in het eindproduct die voor vroegtijdig bederf zorgden en organismes in de biofilms van de betrokken bedrijven. Dit toonde aan dat naast biofilms nog tal van andere factoren, zoals andere hygiënemaatregelen, oorzaak kunnen zijn van productieverliezen en houdbaarheidsproblemen.

Eliminatie van biofilm

In een dynamisch modelsysteem werden vervolgens de meest voorkomende reinigings- en desinfectiemiddelen geëvalueerd op hun effectiviteit voor het verwijderen van biofilms. Dit werd uitgetest voor zowel twee modelorganismes (Lactobacillus rhamnosus GG en E. coli MG1655) als voor de bacteriën geïsoleerd in de bedrijven met het hoogste vermogen tot biofilmvorming. Hierdoor kon per bedrijf een persoonlijk advies worden gegeven voor de meest geschikte reinigings- en desinfectieprocedure.

Voor de reiniging en desinfectie werden twee protocollen ontwikkeld om de verschillende procedures in de bedrijven te simuleren. Het eerste protocol simuleerde een Open Plant Cleaning (OPC)-procedure en het tweede een Cleaning in Place (CIP)- procedure. Voor de meeste geteste bacteriën werd geen statistisch verschil opgemerkt tussen de verschillende reinigings- en desinfectiemiddelen. Opmerkelijk was wel dat de reinigingsstap een grote reductie van de biofilm bewerkstelligde, maar de desinfectiestap na reiniging vaak geen extra biofilmverwijdering veroorzaakte. Dit benadrukt het belang van een goed uitgevoerde reiniging. Desinfectie blijft vooral belangrijk voor de afdoding van de losgekomen bacteriën door de voorafgaande reiniging.

Herhaling om controle te houden

Ondanks de grote reductie van de biofilm door de reinigingsstap zijn de biofilms steeds in staat om na 24 uur volledig opnieuw aan te groeien. Een herhaalde reiniging en desinfectie op geregelde tijdstippen is dus zeer belangrijk om de biofilms onder controle te houden Naast de klassieke reinigings- en desinfectiemiddelen werd tevens een enzymatische reiniging uitgevoerd op de gevormde biofilms. De toegepaste enzymatische reiniging van de firma Realco was in het modelsysteem zeer effectief voor bepaalde bacteriën, waarbij geen teruggroei van de biofilm werd waargenomen. Voor andere sterke biofilmvormers werd geen bijkomende verwijdering waargenomen in vergelijking met de klassieke producten. Ten slotte werd niet enkel de curatieve behandeling van biofilms onderzocht, maar werd ook de preventie van biofilms geëvalueerd aan de hand van een behandeling van het roestvaststaal. Zo belemmerde een gecontroleerd oppervlakteconditioneringsproces (Sublimotion-process) van roestvaststaal de aanhechting van bepaalde organismes en reduceerde dit de heraangroei van de biofilm na reiniging en desinfectie. In het Cleansurfaceproject, een vervolgproject op Killfilm, wordt nu gestart met onderzoek naar de beïnvloeding van het kleefgedrag aan roestvrijstaal door chemische en fysische oppervlaktebehandeling. Ook hiervan worden de resultaten te zijner tijd via VMT gepresenteerd.

Fundamenteel onderzoek

Binnen het Killfilm-project is tevens geprobeerd in de verschillende modelsystemen meer inzicht te verwerven in de gen-expressieprofielen van de diverse bacteriën tijdens de biofilmvorming. Veranderingen in genexpressieprofielen tussen het mono- en multispeciesmodelsysteem kunnen informatie verstrekken over de belangrijke mechanismes voor biofilmvorming van de bestudeerde bacteriestammen. Deze mechanismes vormen mogelijke doelwitten voor gerichte innovatieve biofilm-inhibitoren. Bovendien werden biofilm-inhibitoren geïdentificeerd die implementeerbaar zijn in de reinigings- en desinfectieprotocollen, waaronder 5-aryl-aminoimidazolen, tanninezuur, baicaleïne en nifuroxazid.

Multidisciplinair onderzoek

Het uitgevoerde onderzoek kaderde in het onderzoeksproject Killfilm ‘Controle van biofilmvorming in de productieomgeving om een langere shelf-life te kunnen garanderen’ gefinancierd door Flanders’ FOOD en de daaraan deelnemende bedrijven. Gezien de complexiteit van de problematiek waren hierbij vijf onderzoeksgroepen waren hierbij betrokken: Laboratorium voor Enzym-, Fermentatie- en Brouwerijtechnologie van KU Leuven Technologiecampus Gent – Prof. Verplaetse en T. Vackier, Laboratorium voor Voedingsmicrobiologie en –Biotechnologie van UGent – Prof. Raes,Prof. Sampers, Laboratorium voor Microbiologie van UGent – Prof. Vandamme, Eenheid Technologie en Voeding van het Instituut voor Landbouw-, Visserij- en Voedingsonderzoek (ILVO) – Dr. ir. De Reu,  Prof. Heyndrickx en S. Maes en het Centrum voor Microbiële  en Plantengenetica (CMPG) van de KU Leuven – Prof. Steenackers.

Dr. ir. Koen De Reu, senior onderzoeker en groepsleider Microbiologische voedselveiligheid; Sharon Maes, doctoraatsonderzoeker, ILVO

Reageer op dit artikel