artikel

WGS zal ook in industrie enorme vlucht nemen

Algemeen

WGS zal ook in industrie enorme vlucht nemen

Het RIVM doet ervaring op met Whole Genome Sequencing (WGS), het in kaart brengen van het gehele erfelijk materiaal van micro-organismen. WGS-apparatuur wordt in rap tempo kleiner, nauwkeuriger, nog sneller en veel goedkoper. Daardoor kan ook de levensmiddelenindustrie met WGS een pathogeen identificeren, maar er bijvoorbeeld ook veranderingen in de huisflora mee ontdekken. Als fabrikanten en publieke partijen als RIVM en NVWA WGS-data gaan delen, kan veel leed en schade worden voorkomen. Dit artikel is verschenen in VMT 14 van 23 november 2018.

WGS is een techniek waarmee het DNA van het gehele genoom van micro-organismen in kaart wordt gebracht. De volgorde van de afzonderlijke baseparen wordt daarbij ‘uitgelezen’, ook wel sequencen genoemd. Met name overheidsinstituten en academische ziekenhuizen gebruiken nu nog deze relatief nieuwe techniek voor het identificeren van ziektekiemen. Hierdoor kunnen zij verbanden leggen tussen uitbraken: binnen Nederland, maar ook daarbuiten. Ook kunnen zij hiermee bij een voedseluitbraak met grotere zekerheid vaststellen door welk besmet voedingsmiddel patiënten ziek zijn geworden.

RIVM is de spil

In Nederland is het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM) in Bilthoven de spil in het landelijk uitbraakonderzoek. Vanuit de volksgezondheid is het Centrum Epidemiologie en Surveillance van Infectieziekten (EPI) hierbij nauw betrokken. Eelco Franz is er afdelingshoofd epidemiologie gastro-enteritis en zoönosen. Hij werkt nauw samen met Henk Aarts, afdelingshoofd voedingsmiddelenmicrobiologie bij het Centrum voor Zoönosen en Omgevingsmicrobiologie (Z&O). Aarts’ focus is gericht op de signalering en risicobeoordeling van pathogene micro-organismen die vanuit dieren, voedsel of milieu overdraagbaar zijn naar de mens. Beide centra worden ondersteund door het Centrum Infectieonderzoek, Diagnostiek en Laboratorium Surveillance (IDS) waar veelal de analyses worden uitgevoerd en micro-organismen worden getypeerd en geïdentificeerd.

Micro-organismen karakteriseren

“Voor de surveillance van voedselpathogenen zetten we WGS steeds vaker in”, vertelt Franz. “Daarbij brengen we in kaart welke typen waar in Nederland voorkomen, wat het aantal infecties is en waar deze ziektekiemen vandaan komen.” Behalve dat matchen van ziekte aan de voedselbron, gebruiken de RIVM-onderzoekers WGS toch vooral om de ontdekte micro-organismen te karakteriseren; bijvoorbeeld of deze toxigene stoffen kan aanmaken of dat deze resistent zijn voor bepaalde soorten antibiotica. Ook wordt WGS gebruikt om met behulp van maagdarm- modellen na te gaan welke genen voor welke functionaliteiten en/of ziektebeeld verantwoordelijk zijn. Aarts: “Ook het snel kunnen opsporen van een diffuse uitbraak is een belangrijke reden om WGS in te zetten.” Sequencing Voor het identificeren van micro-organismen wordt hun DNA met behulp van enzymen of shearing in tienduizenden stukjes ‘geknipt’. Van al deze DNA-stukjes worden de baseparen bepaald en opgeslagen. Met behulp van slimme software (bio-informatica) worden de stukjes weer achter elkaar geplakt waardoor als het ware het gehele genoom ontstaat. Bij het analyseren van het DNA kunnen er foutjes worden gemaakt. Daarom worden de DNA-stukjes meerdere keren uitgelezen.

Aarts: “Je kunt het aantal keren op de machine instellen, van enkele tot wel honderd keer of meer.” De software vergelijkt de resultaten en kiest die baseparen die het vaakst zijn uitgelezen. Een enkele fout wordt zo uitgefilterd waardoor resultaten zeer betrouwbaar worden. Maximale nauwkeurigheid is echter vaak niet nodig voor het routinematig screenen of een bekend serotype micro-organisme in een populatie voorkomt of niet. Aarts: “Je zoekt vaak naar bepaalde unieke markers, deeltje van het bacterie DNA die je altijd aantreft in een bepaalde pathogeen. In feite doe je dat ook als je een PCR ontwikkelt: eerst breng je met behulp van WGS het gehele genoom in kaart, vervolgens bepaal je welke DNA-stukjes altijd in de pathogenen van patiënten voorkomen waarna je daarvoor een PCR-kit maakt die dus niet al het DNA, maar alleen dat specifieke stukje, zoekt. Met het oog op de betrouwbaarheid zijn dat vaak meerdere verschillende stukjes DNA.”

Techniek neemt enorme vlucht

Met de eerste, in 1977 ontwikkelde, generatie WGS werd met behulp van radioactieve isotopen van erg kleine stukjes DNA stuk voor stuk de baseparenvolgorde bepaald. Dat was erg tijdrovend. Het in kaart brengen van het menselijke genoom duurde 10 jaar en kostte miljarden euro’s. Omstreeks 2005 kwam de Next generation-apparatuur op de markt, circa 10 jaar later gevolgd door derde generatie-mini-sequencers. RIVM schafte dit voorjaar zelf twee Next generation-machines aan. Eén met een hoge output maar met korte reads en eentje die weliswaar een mindere output heeft, maar wel in staat is langere reads te lezen. Dat is van belang bij ‘in silico’ MLV- typering (typeringsmethode op basis van zich herhalende sequenties in het DNA) en bij 16sRNA-onderzoek (typeringsmethode op basis van variabele stukken DNA in het DNA dat codeert voor ribosomaal RNA). Franz: “Bij deze tweede generatie-machines wordt nog steeds het DNA van bijvoorbeeld een bacterie in tienduizenden kleine stukjes geschoten, maar al die stukjes kunnen in tegenstelling tot de eerste generatie nu tegelijkertijd worden gesequenced. Het uitlezen vergt nog slechts 24-40 uren, terwijl de apparaten zeer nauwkeurig zijn.” Franz geeft wel aan dat het RIVM het gros van de monsters nog steeds uitbesteedt.

Kostenneutraal

Een bepaling met de (tonnen kostende) Next generation-machines schatten de onderzoekers op € 150,- tot € 300,- per isolaat. Franz zet deze kosten in perspectief. “Als je kijkt wat wij allemaal aan ‘natte’ labtesten moeten doen om bijvoorbeeld een Salmonella uit een faecesmonster te typeren. Verifiëren of het een Salmonella is, serotypering om te kijken welke Salmonella dit is, een moleculaire subtypering om te kijken welke type binnen het serovar het is en eventueel kijken naar antibioticaresistentie. Als je al die testen en uren van de laboranten bij elkaar optelt, kom je al snel tot een meervoud van die kosten. Al deze en nog veel meer informatie kun je ook uit de sequentie halen. Dus WGS is nu zeker al kosteneffectief. Voordat we echter met deze nieuwe all-in-one techniek aan de slag gaan, is het noodzakelijk dat de methode is geharmoniseerd en gevalideerd. Dat alles vergt een behoorlijke initiële investering om over te schakelen. Maar uiteindelijk is de WGS uit kostenoogpunt effectiever.”

Derde generatie

RIVM experimenteert momenteel ook met de derde generatiemini- sequencers. Deze zijn door hun geringe omvang (ter grootte van een powerbank voor een mobiel), relatief lage kosten (duizenden euro’s) en omdat met deze technologie erg lange stukken DNA te analyseren zijn, sterk in opkomst. Binnen twee dagen is het gehele genoom van een micro-organisme uit te lezen. Bij de analyse met de derde generatie-minisequencers wordt het genoom in een beperkt aantal grote stukken geknipt. Deze worden minder vaak en daardoor ook minder nauwkeurig uitgelezen waardoor de foutmarge ervan groter is dan bij de grote Next generation-machines. Aarts: “We gebruiken deze techniek vooral voor onderzoeksdoeleinden en het in kaart brengen van het gehele genoom, zodat de bio-informatica alle kleine stukjes a omstig uit de Next generation-sequencers gemakkelijk aan elkaar kan lezen.”

Aarts vervolgt: “Door de mini-sequencers aan een pc te koppelen, kunnen onderzoekers op locatie de sequentieanalyse uitvoeren en de data analyseren. Daardoor is sneller vast te stellen welke ziektekiem een patiënt bij zich draagt en bijvoorbeeld met welk antibioticum hij moet worden behandeld. De nieuwste typen mini- sequencers kunnen zelfs al aan een mobiel worden gekoppeld. Zoals gezegd: de ontwikkelingen gaan snel, zo niet exponentieel.” Franz vult aan: “Nadeel is wel dat je slechts één isolaat per keer kunt sequencen, maar ook bij deze techniek zie je al dat de capaciteit wordt uitgebreid – eenvoudig gezegd – door meerdere mini-sequencers aan elkaar te koppelen. Die ontwikkeling zal alleen maar doorzetten en gaat erg snel.” Het biedt volgens Franz enorme mogelijkheden voor bijvoorbeeld het veldonderzoek naar Ebola en Zika. “Denk ook aan onderzoek op het gebied van hoe micro-organismen zich aan hun omgeving aanpassen.” Big smile en pretogen. “Je kunt met je sequencer naar een geiser of de Zuidpool en deze micro-organismen ter plekke sequencen en via aanvullend onderzoek nagaan welke genen verantwoordelijk zijn voor hitte- of kouderesistentie.”

Huisflora en microbioom

In de ziekenhuisdiagnostiek wordt WGS in toenemende mate gebruikt voor het in kaart brengen van de totaal aanwezige populatie micro-organismen in een patiëntmonster (bloed, urine, feces). Aarts: “Niet door stuk voor stuk het genoom te sequencen, maar door deze als het ware in één monster te verzamelen en deze in de Next generation-sequencer in één keer uit te lezen. Op zo’n manier kun je het microbioom van de darm van patiënten in kaart brengen. Je sequenct al het in het monster aanwezige DNA, of een specifieke sequentie die in alle bacteriën aanwezig is, en met behulp van bio-informatica achterhaal je vervolgens welke stukjes DNA matchen met bepaalde delen van het DNA van de aanwezige micro-organismen.”`

Voedingsmiddelenfabrikanten zouden de techniek van metagenomics ook kunnen toepassen voor het monitoren van hun huisflora. In een run krijgen zij daarmee een overzicht van welke micro-organismen – van bacteriën en virussen tot gisten en schimmels – in het omgevingsmonster, en dus in hun fabriek, aanwezig zijn. Kweken hoeft niet, maar de keerzijde daarvan is wel dat, wil je kleine aantallen micro-organismen in het monster detecteren, je heel diep moet sequencen. Dus vele herhalingen moeten uitvoeren. Vandaar dat de kosten voor een dergelijke bepaling al snel meer dan vierhonderd, vijfhonderd euro gaan bedragen. Dat is nu nog te hoog om een dergelijke analyse routinematig in te zetten.” Een ander potentieel probleem bij metagenomics is het verkrijgen van voldoende DNA uit monsters waar relatief weinig microorganismen inzitten: bijvoorbeeld lucht, of van een oppervlak na desinfectie. Goede monstervoorbereiding door microbiologen is dus nog steeds zeer noodzakelijk.

Poolse eieren met Salmonella Enteritidis

Een recente uitbraak waarbij WGS een grote rol speelde, was de besmetting van Poolse eieren met Salmonella Enteritidis. Eelco Franz: “In Engeland en Wales (VK) steeg het aantal besmettingen. Toen nieuwe patiënten uitbleven, stopte dat onderzoek. Maanden later kwam de GGD Amsterdam naar ons toe met een cluster consumenten met Salmonella Enteritidis die allemaal in hetzelfde restaurant hadden gegeten. Het was hetzelfde type als eerder in Engeland en Wales. Daarna startte een internationaal uitbraakonderzoek onder coördinatie van de ECDC, het Europees Centrum voor ziektepreventie en -bestrijding. Alle isolaten zijn gesequenced.”

Betere uitbraakdefinitie opstellen

“Belangrijkste meerwaarde van de WGS was dat we een veel betere uitbraakdefinitie konden opstellen. Restaurantbezoek bleek een duidelijke risicofactor. Een signaal uit Noorwegen leidde toen naar een Poolse eierexporteur. Dat bleek dezelfde stam als die de NVWA in beeld had bij het kleine, eerdergenoemde restaurantcluster in Noord-Holland.” De NVWA zorgde vervolgens voor het traceren en blokkeren van de importstromen. “Nog lang na de uitbraakpiek in Europa werden en worden gerelateerde ziektegevallen gemeld. Maatregelen in de primaire sector afdwingen zodat deze voldoen aan de Europese wetgeving is blijkbaar moeilijk. Nederland kan alleen de import goed controleren en zonodig partijen blokkeren.”

Toekomst WGS

Aarts: “In al het onderzoek waarbij DNA is betrokken, gaat WGS een belangrijke rol spelen. WGS wordt op termijn zo algemeen, zo toepasbaar, zo snel en zo goedkoop. En je krijgt er zoveel extra informatie gratis bij. Het zal daarom een enorme vlucht nemen, ook gezien de vele nadelen van de huidige methoden. Voor serotyperen, wat de meeste bedrijven niet zelf doen, moet je in het bezit zijn van een groot palet aan antilichamen. Deze informatie is ook aanwezig in het DNA, waardoor WGS een erg aantrekkelijke optie wordt. Zeker als je bedenkt dat veel meer informatie uit het genoom kan worden afgelezen. Denk aan antibiotica-resistentie, maar bijvoorbeeld ook resistentie tegen decontaminatiemiddelen.” Franz: “Voor metagenomics, dus het in één klap in kaart brengen van alle micro-organismen die je in een monster uit je fabriek of grondstof hebt verzameld, geldt hetzelfde. Nu heb je daar nog tig verschillende testen voor nodig, maar dat hoeft niet meer. Isoleren, koloniën met de hand tellen, enzovoorts is dan verleden tijd.” Aarts: “Als je regelmatig je huisflora op deze manier in kaart brengt, en dus volgt in de tijd, dan zou je kunnen zien of bepaalde stammen meer of minder voorkomen en of dat bijvoorbeeld komt omdat deze zich hebben aangepast aan omstandigheden als bijvoorbeeld verhitten, zuurgraad en desinfectiemiddelen.” Franz: “In de gezondheidszorg kun je met WGS op basis van de sequentie voorspellen tegen welke antibiotica een bacterie resistent is en voor welke niet. Dus je hebt al heel snel een eerste indicatie welke antibiotica je niet moet geven.

Beschikbaar stellen van sequenties

Volgens de RIVM-onderzoekers zijn grote voedingsmiddelenconcerns al met WGS bezig en zal een groot deel van de industrie binnen afzienbare tijd deze voorlopers volgen en WGS-analyses (laten) uitvoeren. Franz: “De vraag is: wat ga je met al die data die je als bedrijf genereert doen? Idealiter zou iedere fabrikant zijn data, dus alleen de sequenties, niet de bijbehorende metadata, realtime kunnen opladen in een gemeenschappelijke database die de sequenties vergelijkt en je attendeert op mogelijk andere bronnen van hetzelfde organisme. Dat zou ons bij uitbraken een enorme tijdswinst opleveren bij het achterhalen van de bron.” Franz: “Met WGS kan een pathogene stam met aan vrijwel zekerheid grenzende waarschijnlijkheid worden gerelateerd aan de oorsprong, iets dat met de huidige, grovere typeringen tot nu toe minder eenduidig kon. Een fabrikant zal om die reden sequenties van de in zijn fabriek of op zijn producten gevonden micro-organismen niet snel prijsgeven. Dat kan namelijk grote gevolgen hebben voor zijn afzet. Op landelijk niveau – als blijkt dat meer bedrijven problemen hebben met dezelfde pathogeen – zou dit zelfs de exportpositie schade kunnen toebrengen.”

Bij de EHEC-uitbraak in 2011 had Europa te maken met een zeldzame stam die een combinatie van virulentiegenen bevatte. Als de onderzoekers destijds hadden geweten dat een dergelijk type al eerder was gezien, hadden mogelijk veel eerder mensen kunnen worden behandeld, hadden minder mensen het HUSsyndroom opgelopen en waren er ook minder mensen aan overleden. Aarts: “Je faciliteert als het ware je eigen vervolging, dat wordt wel eens gezegd. Maar wat is daar mis mee? Bij een grote uitbraak word je als fabrikant toch getraceerd. Bij Salmonella Thompson werden 1400 mensen ziek en stierven er vier. Als we via een gedeelde database met sequenties in een vroeg stadium links kunnen aantonen tussen klinische isolaten en voedselisolaten zou dat ziekte, en wellicht uitbraken, kunnen voorkomen. Dat is in het belang van de volksgezondheid en de industrie. Misschien goed voor de industrie om te weten: een DNA-match is geen sluitend bewijs. Het kan ook toeval zijn dat de patiënt de pathogeen heeft opgelopen. Je moet echt kunnen aantonen dat een patiënt ziek is geworden door het eten van voedsel dat besmet is met de gevonden pathogeen.”

Reageer op dit artikel