artikel

Kwaliteit media heeft grote invloed op resultaten

Algemeen

De kwaliteit van microbiologische media heeft grote invloed op het verkrijgen van een betrouwbaar resultaat. Of je de media nu zelf maakt uit de losse bestanddelen, bereidt uit een pot met kant-en-klaar medium of gebruiksklaar koopt, de belangrijkste vraag is: doen ze wat ze moeten doen? Dit artikel is verschenen in VMT 14 van 23 november 2018.

Met dat doel is de norm NEN-EN-ISO 11133 opgesteld. Deze norm bevat voorschriften over de bereiding, productie, bewaring en de bepaling van de prestatiekenmerken van voedingsmedia. Voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten is een juiste samenstelling en werking van de voedingsbodem van groot belang. Wat de resultaten ook kan beïnvloeden zijn de voedingsstoffen, (s)electieve stoffen en bindmiddelen die de media – naast water – bevatten. Een aantal van die stoffen is chemisch niet gedefinieerd. Het zijn vaak (extracten van) natuurproducten: bloed, eidooier, gal, gist, hersenen, lever, vlees en de bindmiddelen agar en gelatine. Het gebruik hiervan kan variaties tussen verschillende batches van media opleveren. Dat kan leiden tot verschillen in groei van kolonies en daardoor verschillen in de resultaten. Terwijl er bij gebruik van uitsluitend chemisch gedefinieerde stoffen constant controle kan plaatsvinden op hun zuiverheid en de kans op verschillen in resultaten daardoor veel kleiner is.

Kwaliteit van water

waterGewoon (leiding)water is ongeschikt voor gebruik in voedingsmedia vanwege de hardheid en eventueel aanwezige (groeiremmende) verontreinigingen. Calciumionen in hard water kunnen bijvoorbeeld reageren met fosfaten uit peptonen en neerslagen veroorzaken. Ook zware metalen en organische verontreinigingen kunnen de werking van de media negatief beïnvloeden. Door leidingwater te destilleren of te deioniseren is het wel geschikt te maken. Dat kan met behulp van destillatieapparatuur of via omgekeerde osmose (reversed osmose, RO). Op deze manier wordt demiwater verkregen: water dat (bijna geheel) vrij is van storende componenten. Aan het demiwater worden de volgende eisen gesteld: • De geleidbaarheid van het demiwater moet minder dan 25 μSiemens per cm (μS/cm) zijn, de pH moet minimaal 5,5 bedragen. • Het kiemgetal (68 ±4 uur bebroeden bij 22°C) dient lager te zijn dan 1000 kve/ml en bij voorkeur minder dan 100 kve/ml.

Veelgemaakte fouten

De meestvoorkomende fouten die worden gemaakt bij het bereiden van microbiologische media zijn het verkeerd afwegen van de benodigde ingrediënten, onjuist autoclaveren (geen kalibratie van temperatuurmeter, onjuist beladen), onjuist instellen van de pH, en/of het gebruik van een niet (regelmatig) geijkte pHmeter, onjuist afkoelen van de bereide media, (te lang) bewaren van bereide media en het verkeerd registreren van de handelingen en het vastleggen hiervan. In de twee normen NEN-EN-ISO/IEC 17025:2018 (Algemene eisen voor de competentie van beproevings- en kalibratielaboratoria) en NEN-EN-ISO 7218:2007 (Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders – Algemene eisen en richtlijn voor microbiologische onderzoeken) worden deze aspecten uitgebreid behandeld. Voor laboratoria die een NEN-EN-ISO 17025-accreditatie hebben en zelf media bereiden, zijn er extra eisen die te maken hebben met de aantoonbaarheid van het juist uitvoeren van de bereidingsstappen. Registraties van een aantal stappen in het proces zijn hierbij van belang. Te beginnen bij het afwegen van de componenten van het medium. Dit kan handmatig, maar het is veel makkelijker om een balans te gebruiken die met een printer verbonden is. Of nog beter: een systeem met de receptuur gekoppeld aan een balans en een barcodereader voor het gebruik van de juiste componenten. Het stellen van de pH is belangrijk. Kalibreer de pH-meter dagelijks voor gebruik met behulp van twee pH-standaarden (bijvoorbeeld pH 4 en pH 10) en controleer daarna met een derde buffer (bijvoorbeeld pH 7). Registreer de gegevens van de controle-pH en de helling (slope) van de lijn die door de meeste pH-meters bij de kalibraties wordt gegeven. Bij het sterilisatieproces is het van belang dat van elk sterilisatieproces de tijd en temperatuur wordt geregistreerd.

Toetsen van voedingsmedia

Celcultuur petriHet maakt niet uit of je het medium zelf maakt uit de losse bestanddelen, bereidt uit een pot met een kant-en-klaar medium, of dat je media gebruiksklaar koopt in flessen of petrischalen. Controle van deze media is noodzakelijk: voldoen ze aan de gestelde criteria met de toetsstammen? Het toetsen van voedingsmedia kan op drie manieren: kwantitatief, semi-kwantitatief en kwalitatief. De kwantitatieve methode wordt voornamelijk toegepast bij bijvoorbeeld het testen van nieuw ontwikkelde media of wanneer media van een nieuwe leverancier afkomstig zijn. Bij deze test wordt bepaald of de productiviteit en selectiviteit overeenkomstig (of beter) is dan die van reeds bestaande en/of gebruikte media. Voor de eindgebruiker van de media volstaat in de meeste gevallen de uitvoer van semi-kwantitatieve en/of kwalitatieve testen waarbij wordt vastgesteld of de werking van de media van voldoende niveau is (productiviteit en selectiviteit). In de norm NEN-EN-ISO 11133:2014 (Microbiologie van voedingsmiddelen, diervoeders en water – Bereiding, productie, bewaring en bepaling prestatiekenmerken van kweekmedia) staan tabellen die aangeven welke methode moet worden toegepast voor het testen van de verschillende soorten media (kwantitatief, semikwantitatief of kwalitatief), de te gebruiken toetsstammen voor de productiviteit en selectiviteit, de bebroedingsduur en -temperatuur, de referentiemedia en de criteria voor de beoordeling van de kwaliteit. Algemeen geldt dat de uitvoering van de verschillende methoden zoveel mogelijk moet worden gestandaardiseerd. Denk bijvoorbeeld aan het volgende: gebruik dezelfde soort öse (kunststof, metaal), steek alleen de öse in de bouillon (en niet de steel daarboven), de voedingsbodem waarop wordt afgestreken dient bij iedere bepaling even oud te zijn (1-7 dagen) en bebroed volgens voorschrift.

Interpretatie resultaten

De resultaten van het kwantitatieve mediumonderzoek kunnen in controlekaarten worden opgenomen (figuur 1). Dit wordt ook toegelicht in Bijlage G van de norm NEN-EN-ISO 11133. Hiermee wordt een goed overzicht verkregen van de spreiding die optreedt in de resultaten tussen de verschillende batches. De controlekaarten worden gemaakt op basis van de productiviteitsratio. Voordat een controlekaart kan worden aangemaakt zijn er minimaal 10, maar liever 20 metingen nodig. Van deze data wordt het gemiddelde (xgem) en de standaarddeviatie (sd) berekend. Met het gemiddelde en de standaarddeviatie worden vervolgens de controlegrenzen berekend. De controlegrenzen zijn de waarschuwingsgrenzen (95% betrouwbaarheidsgrens) die worden berekend als (xgem +/- 2 x sd) en de alarmgrenzen (99% betrouwbaarheidsgrens) die als (xgem +/- 3 x sd) worden berekend. Aan de hand van beslisregels die zich zowel richten op een incidentele afwijking (productiviteitsratio ligt buiten de alarmgrens) als op de trend in de waarden (bijvoorbeeld productiviteitsratio ligt 6 maal opeenvolgend boven of onder het gemiddelde).

Media controlekaart

Belang van analysecertificaten

Analysecertificaten zijn een handig hulpmiddel voor een lab om te weten of ze het juiste product hebben aangeschaft. Ze bevatten gegevens over de kwaliteitscontrole van het medium. Helaas komt het regelmatig voor dat ze geen batch specifieke gegevens bevatten. Deze certificaten hebben dan geen meerwaarde voor geaccrediteerde laboratoria.

Tegenwoordig zijn er steeds vaker certificaten waarbij de microbiologische controles worden uitgevoerd volgens NEN-EN-ISO 11133. Dat heeft als voordeel dat ze dan dezelfde stammen gebruiken als die in NEN-EN-ISO 11133 staan genoemd maar controle hierop laat zien dat deze niet altijd identiek zijn. Geaccrediteerde laboratoria kunnen de inhoud van certificaten zonder verdere controles gebruiken wanneer die controles zijn uitgevoerd door een geaccrediteerd laboratorium. Er zijn tegenwoordig mediaproducenten die een accreditatie hebben voor de controle van media op basis van NEN-EN-ISO 11133. Deze certificaten betekenen niet dat er een zeer uitgebreide controle is gedaan van elke batch. Om aan NEN-EN-ISO 11133 te voldoen moet minimaal 1 plaat gebruikt worden voor de productiviteitscontrole. Onafhankelijk of er nu een batch wordt geproduceerd van 100 platen of van 100.000 platen.

Nawoord

Het bovenstaande heeft betrekking op de klassieke levensmiddelenmicrobiologie en de daarin genoemde methoden van microbiologisch onderzoek (‘gouden standaard’). In de praktijk worden vaak snelle(re) methoden gebruikt zoals immunologische en DNA-technieken. Men moet dan bedacht zijn op vals positieve en vals negatieve monsters. Door kruisreacties met andere micro-organismen dan de gezochte soort kunnen vals positieve resultaten ontstaan. Daarom is het noodzakelijk een positief verkregen resultaat met een ‘snelle’ methode te bevestigen door de ophopingsbouillon uit te strijken op een geschikt isolatiemedium. Vals negatieve resultaten kunnen worden verkregen door een (te) snel groeiende begeleidingsflora in de ophopingsbouillon, door het gebruik van (te) korte ophopingstijden en/of door gestreste cellen in het monstermateriaal (erg, droog, erg zuur).

Auteur: Rijkelt Beumer, levensmiddelenmicrobioloog, Wageningen Universiteit; Stichting FiMM

Literatuur

Reageer op dit artikel