artikel

Flowcytometrie is sneller, gevoeliger, specifieker

Algemeen

Flowcytometrie biedt een snel en gevoelig alternatief voor standaard microbiële detectiemethodes. De methode kan bovendien nuttige kwantitatieve en kwalitatieve informatie verschaffen omtrent de microbiële populatie. Een recente ontwikkelingen op het gebied van de flowcytometrie is de ontwikkeling van compacte toestellen die werken met een laserdiode. Een compacte flowcytometer met een groene laserdiode werd geëvalueerd op zijn doeltreffendheid als microbiologisch kwaliteit-, proces- en hygiënebeoordelinginstrument in verschillende voedingsectoren en bij de evaluatie van gist- en starterculturen.

Cytometrie, letterlijk het meten (-metrie) van cellen (cyto-), kan gaan over fysische celeigenschappen (lengte, volume, et cetera) of over biochemische/moleculaire celeigenschappen (eiwitinhoud, vetinhoud, enzymatische reacties, enzovoort). De metingen gebeuren terwijl de cellen in een vloeistofstroom (flow) langs een reeks vaste detectoren bewegen. Meestal worden de cellen (micro-organismen) met een kleurstof (fluorochroom) gekleurd.

Een flowcytometer is opgebouwd uit een flowcel, een lichtbron (gewoonlijk een laser), optische lenzen en filters, detectoren en een computer voor signaal- en dataverwerking. In de flowcel zullen cellen, al dan niet gekleurd, door hun vorm en inhoud het laserlicht verstrooien. Anderzijds kunnen gebonden fluorochromen worden geëxciteerd en licht uitzenden (emissie) met een langere golflengte dan het excitatielicht. Het verstrooide en uitgezonden licht wordt door detectoren omgezet naar een elektrisch signaal, dat aan de hand van software kan worden geanalyseerd. Tussen de flowcel en de detectoren zit een reeks optische lenzen en filters om excitatie- en emissielicht te scheiden.

Parameters
Afhankelijk van de uitrusting van de flowcytometer kunnen verschillende parameters worden opgemeten. De lichtverstrooiing van een cel is afhankelijk van de celgrootte, oppervlakte celruwheid, brekingsindex van de celcomponenten, en de interne celgranulariteit. Naast lichtverstrooiing worden met een flowcytometer ook fluorescenties (FL1, FL2, et cetera) gemeten.

De fluorescerende kleurstoffen, met een specifieke excitatie- en emissiegolflengte, worden ingedeeld naar hun manier van interactie met de cel (figuur 1). Sommige binden met specifieke celcomponenten zoals eiwitten, nucleïnezuren en lipiden, terwijl andere een fluorescentie geven die wordt bepaald door cellulaire parameters (zoals pH of membraanpotentiaal) en enzymatische activiteit. De fluorochromen kunnen eveneens gekoppeld worden aan antilichamen en nucleotideprobes om rechtstreeks een aantal microbiële antigenen of DNA- en RNA-sequenties te detecteren.

Kwaliteitscontrole
FCM wordt al op diverse plaatsen toegepast voor de kwaliteitscontrole van levensmiddelen. De techniek wordt toegepast bij het onderzoek van starterculturen en het opvolgen van fermentatieprocessen. Met passende fluorochromen wordt de graad van celbeschadiging van gedroogde, gevriesdroogde en diepgevroren geconcentreerde culturen nagegaan. Routineanalyse van de melkkwaliteit kan worden uitgevoerd met de Bactoscan-flowcytometer (Foss-Denemarken). Reeds enige tijd wordt met bijvoorbeeld de Chemflow/D-count van Chemunex S.A. gistcontaminatie in yoghurt of steriliteit van fruitsappen gemeten. In de brouwerij wordt deze techniek gebruikt voor procescontrole, procesoptimalisatie en kwaliteitscontrole.

Pathogenen
Met FCM kunnen niet alleen algemene kwaliteitsparameters (totaal kiemgetal, aantal levensvatbare kiemen) worden bepaald, maar ook pathogene micro-organismen opgespoord. Hiervoor worden specifieke merkers gebruikt om de pathogene cultuur tussen de andere in het product aanwezige micro-organismen te kunnen detecteren. Dit kan bijvoorbeeld door een fluorescerende kleurstof te binden aan antistoffen, specifiek voor de te bepalen cultuur. De gelabelde antistoffen kunnen dan binden aan deze cultuur (immunolabeling) en met de flowcytometer kan de fluorescentie gemeten worden. Ook kan een scheidingstechniek, immunomagnetische separatie (IMS) gekoppeld worden aan FCM. IMS is een eenvoudige techniek om een bepaald organisme te isoleren uit een heterogene groep bacteriën, zoals in voedsel. De techniek steunt op de interactie tussen antigenen op het celoppervlak van de bacteriën en antistoffen die aan paramagnetische pareltjes vastzitten. De gewenste cellen worden gescheiden door de suspensie met de pareltjes in een sterk magnetisch veld te brengen. Door de antilichamen op de paramagnetische pareltjes te labelen (= er een fluorescerende kleurstof op te binden), kan met de flowcytometer een onderscheid worden gemaakt met en zonder bacteriën.
Naast antistoffen kunnen ook nucleotideprobes gelabeld worden die dan kunnen gebruikt worden voor identificatie.

Knelpunten
De microbiologische voedingstoepassingen van FCM zijn veel minder ver ontwikkeld dan de toepassingen in de studie van de fysiologie van menselijke cellen. Redenen daarvoor zijn onder andere dat de apparatuur in eerste plaats gebouwd werd voor de detectie van dierlijke cellen. Aangezien bacteriën veel kleiner zijn (circa 1 µm groot), kunnen deze net tegen de detectiegrens van het toestel liggen. Gisten leveren qua grootte (circa 5-10 µm) minder problemen op.

Verder geldt dat de kleurstoffen niet zijn aangepast aan micro-organismen: de werking van fluorochromen bij dierlijke cellen is goed gedocumenteerd, maar er is minder bekend over de werking binnen microbiële systemen. Binnen de groep micro-organismen treden ook nog verschillen op qua kleuringefficiëntie. Derde knelpunt is dat micro-organismen nog geen 0.0001% vertegenwoordigen van de in voedsel aanwezige deeltjes. Dit maakt een extra monstervoorbereidingstap zoals filtratie, centrifugatie of enzymatische behandeling nodig om interferentie van de matrix (het voedingsmiddel) te minimaliseren. Bovendien moeten de cellen in een vloeistof worden gesuspendeerd. De detectielimiet van het instrument kan een vooraanrijkingsprocedure van het te onderzoeken monster noodzakelijk maken. Dit kan de kwantitatieve detectie van een specifiek organisme bemoeilijken. Vierde probleem is dat de storende voedingsmatrix ook kan interfereren met de niet-specifieke binding van de kleurstoffen. Ten vijfde zijn flowcytometers duur in aanschaf. Een toestel met vijf parameters en Argonlaser kost al € 80.000 of meer. En last but not least geldt dat er nog altijd speciaal opgeleid personeel nodig is om de vele resultaten van het toestel op een juiste manier te interpreteren.

Compacte laserdiode
Er wordt gewerkt aan het reduceren van de hoge kosten van FCM door de elektronische en optische onderdelen en computers aan te passen. Zo zijn lasers inmiddels een stuk in prijs gedaald. Tegenwoordig bestaan er compacte diodelasers met een lage kostprijs ( 10.000 uur). Nieuwe FCM-systemen met een solid-state laser en lage elektrische en koelingvereisten maken het toestel veel kleiner en sterker, en er zijn zelfs draagbare systemen ontwikkeld voor veldanalyse.

Aan de Hogeschool Gent loopt reeds twee jaar een project waarin zo’n compacte, relatief goedkope flowcytometer (Bactiflow GL100) wordt geëvalueerd. Dit toestel is uitgerust met een 100 mW YAG groene laserdiode, werkzaam bij 532 nm en kan hierbij tegelijkertijd vier celparameters meten (twee scatters FSC & SCC en twee fluorescenties, oranje FL1 & rode FL2 – figuur 2). Belangrijk onderdeel van het onderzoek is het ontwerpen van protocols voor monsterbehandeling en flowcytometrische analyses van verschillende voedingsproducten voor de bepaling van het totaal aantal cellen.

Viabiliteitanalyses
Met FCM kan onderscheid worden gemaakt tussen levende en dode bacteriën en gisten. Bij de analyse met de fluorochrome stoffen Syto81 en propidium jodide (PI) worden twee kleurstoffen gebruikt die binden op DNA-RNA en die verschillen in hun mogelijkheid om een microbiologisch celmembraan te doordringen. Cellen met een intact membraan staan enkel toe dat Syto81 de cel binnendringt en oranje fluoresceert, terwijl die met beschadigd membraan toestaan dat PI de cel binnendringt en rood fluoresceert (figuur 3). Een andere FCM-meting is mogelijk met DiSBAC(2)3. Dit is een anionische kleurstof die minder goed bindt en fluoresceert bij een actief membraan (levende en actieve cellen met membraanpotentiaal) dan in niet-actieve en dode cellen (zonder membraanpotentiaal).

Nieuwe applicaties
Tabel 1 geeft een aantal applicaties van voedingsmiddelenonderzoek met de Bactiflow GL100 weer. Zo is een snelle somatische celanalyse in melk mogelijk met een nauwkeurigheid van 10.000 somatische cellen ml-1. Hierdoor kan eenvoudig en snel een hoog celgetal in melk worden opgespoord, wat gewoonlijk wijst op (subklinische) mastitis. Het flowcytometrisch opsporen van gisten in gefermenteerde verse zuivelproducten kan gewoonlijk pas na een voorafgaande monsterbehandeling.

Een nauwkeurige en snelle analyse van het totaal bacterieel kiemgetal in melk was niet mogelijk met de Bactiflow GL100. Hierbij werden melkbehandelingstappen en klaringsprocedures om optische belemmeringen te vermijden getest. Dit resulteerde steeds in hoge achtergrondaantallen (te wijten aan lichtverstrooiing en een hoog gehalte niet-bacterieel DNA in de melk waarop de gebruikte DNA-fluorochromen binden) en het was niet mogelijk om de bacteriële flowcytometertelling in melk ( 105 counts g-1) te hoog om betrouwbare resultaten te kunnen afleiden.

Op gisten zijn verschillende kleurstoffen onderzocht, op basis van celmembraanintactheid en membraanpotentiaal, voor de bepaling van de celviabiliteit. Deze procedures blijken veel sneller, objectiever en nauwkeuriger te zijn dan de standaard methyleenblauw microscopische viabiliteitsmethode.
Relatief eenvoudig en snel is het mogelijk om microbiologische contaminanten in bier en andere dranken op te sporen. De minimale detectielimiet van gisten en melkzuurbacteriën in bier is respectievelijk log 2 – log 4 kve ml-1 en log 3 – log 4 kve ml-1 afhankelijk van het bier en de monsterbehandeling, namelijk centrifugatie en wassen.

De flowcytometrie PI-Syto81-procedure werd tevens toegepast op starterculturen (gevriesdroogd en bevroren concentraat) en probiotische producten (gevriesdroogd en commerciële probiotische dranken). In elk van de producten waren de bacteriën heterogeen met betrekking tot membraanintegriteit.

Conclusie
De beschikbaarheid van goedkopere, effectieve en lang meegaande diodelasers vergroot het aantal potentiële toepassingen van flowcytometrie in de voedselmicrobiologie. Ook de verdere ontwikkeling van fluorescentie kleurstoffen (fysiologische en moleculaire probes) dragen bij aan de mogelijkheid om de fysiologie van microben vast te stellen en micro-organismen in voedsel te detecteren.

Reageer op dit artikel