artikel

Analyse allergenen ontrafeld

Algemeen

Analyse allergenen ontrafeld

Verkeerde declaratie van allergenen is de tweede oorzaak van alle recalls. Voor een betrouwbare weergave is een goed allergenenmanagement voor een bedrijf van groot belang. Misschien nog wel ingewikkelder voor een laboratorium is het produceren van een betrouwbaar analyseresultaat. Een nieuwe toepassing van de LC-MSMS lijkt veelbelovend. Dit artikel is verschenen in VMT 9 van 31 augustus 2018.

Laboratoria gebruiken voor het analyseren van allergenen doorgaans ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) en PCR (Polymerase Chain Reaction). Daarnaast zijn er sneltesten. Deze zijn gebaseerd op dezelfde principes als bij ELISA en PCR. In het VMT-artikel ‘Allergeenanalyse en procesvalidatie’ (17 juni 2016) zijn beide methoden uitvoerig toegelicht.

Nadelen ELISA-methoden

Een probleem bij de ELISA-methoden (kader) zijn de gebruikte antistoffen tegen de allergenen. De ELISA-kits zijn gewoon te koop, maar leveren geen eenduidig resultaat (tabel 1). Die verschillen hebben onder andere te maken met de wijze waarop de in deze kits gebruikte antistoffen zijn gemaakt: tegen processed food of tegen een zuivere stof. Dat maakt een groot verschil. Zelfs zo groot dat de ene ELISA-kit niets meet, terwijl de andere kit in hetzelfde monster wel een positief resultaat geeft. Ook gebruiken kitfabrikanten verschillende soorten en aantallen antistoffen tegen de allergenen: de ene gebruikt drie tot zeven verschillende antistoffen in zijn kit, terwijl een andere maar met een antistof werkt. Tot slot interpreteren kitfabrikanten eenzelfde standaard verschillend. Op dit moment is dat een wezenlijk probleem bij de ontwikkeling van analyses voor allergenen. Dat geldt overigens ook voor de LC-MSMS-methode. Ringtesten geven wel enig inzicht in de betrouwbaarheid van de resultaten van de labanalyses. Al deze aspecten maken ELISA niet onbruikbaar, maar vergen van de laborant wel enige ervaring en het nodige uitzoekwerk welke ELISA-kit voor het monster de juiste is. Er zijn echter ook ELISA-kits die echt niet de juiste informatie opleveren. Omdat fabrikanten vaak belangrijke achtergrondinformatie over hun kit achterhouden, heeft Nutrilab zelf veel onderzoek verricht en kennis opgebouwd.

Nadelen PCR-methode

De PCR-methode maakt meestal gebruik van een specifieke primer. De fabrikant verstrekt doorgaans geen informatie over welke primer gebruikt is. Daarnaast is het lastig om het aangetoonde DNA-materiaal om te rekenen naar allergeen eiwit of naar product. Zowel ELISA als PCR hebben last van kruisreactiviteit waardoor vals-positieve resultaten ontstaan. Een ELISA tegen selderie is niet mogelijk vanwege 100% kruisreactiviteit met wortel. Hiervoor is een PCR-methode ontwikkeld. Vaak hebben fabrikanten niet alle voedingsmiddelen getest waardoor kruisreactiviteit niet altijd bekend is. Ook heeft de PCR-techniek – net als veel ELISA’s – zijn beperkingen als het gaat om sterk verhitte producten. Voordelen van ELISA en PCR zijn dat ze relatief goedkoop en snel uit te voeren zijn. Een belangrijk punt voor analysemethoden (inclusief LC-MSMS) dat geldt voor alle 14 hoofdgroepen van allergenen, is het wel of niet specifiek aantonen van het allergene deel van het betreffende allergeen. Wanneer mensen allergisch zijn voor bijvoorbeeld pinda, reageren zij op een paar specifieke allergene pinda-eiwitten. De huidige allergenenmethoden zijn er niet op gericht om die specifieke allergene eiwitten aan te tonen. Voordelen en nadeel LC-MSMS De LC-MSMS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) is een nieuwe, chemisch- analytische methode om allergenen mee te detecteren (kader, pag. 32). De methode kan zeer nauwkeurig concentraties berekenen en is inzichtelijk voor iedereen. De methode start met het isoleren en digesteren (in stukjes knippen) van de eiwitten. Anders dan bij ELISA worden geen antistoffen gebruikt, maar wordt gezocht naar soortspecifieke eiwitten. Juist met de LC-MSMS-methode is het mogelijk om ook te kijken naar de eiwitdelen die verantwoordelijk zijn voor de allergene werking. De methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van ELISA en PCR:

• De methode is ook in te zetten bij zeer hoog verhitte producten (bijvoorbeeld frituurvet en daarin bereide producten).

• De methode is zeer specifiek. In principe is PCR dat ook, maar door de ondoorzichtigheid van de gebruikte PCRprimers, geeft LC-MSMS meer onderscheidingsmogelijkheden. Nutrilab kan bijvoorbeeld selderijblad, knolselderij of bleekselderij onderscheiden.

• Alle eiwitallergenen zijn in een run te meten.

• Nieuwe allergenen zijn eenvoudig en snel toe te voegen aan de methode (bijvoorbeeld pijnboompitten oftewel pine nuts: valt in de Verenigde Staten onder noten) boekweit en kokos: ook een allergeen uit de VS).

• Wanneer meerdere allergenen in een monster moeten worden gemeten, is LC-MSMS een goedkopere methode dan alle afzonderlijke ELISA- en PCR-testen.

• Het gebruik van een interne standaard maakt het mogelijk extractierendement en -verlies te berekenen.

• Zeer goed onderling vergelijkbaar. Wanneer de methode wereldwijd verspreid is, is de verwachting dat de juistheid een beter en consistenter beeld laat zien dan bij ELISA en PCR. Een belangrijk nadeel van de LC-MSMS is de enorme complexiteit: een monster bevat erg veel soorten eiwit en in die brij moet het juiste eiwit worden gevonden. Daarnaast moet het ook specifiek zijn voor de soort. Sommige eiwitten komen in meerdere soorten grondstoffen voor en zijn daardoor niet specifiek.

Toepassing bij zuivelproducten

Een allergene reactie op melk is de meest voorkomende allergene reactie bij kinderen. De eiwitten die in melk voorkomen, zijn α-caseine S1, α-caseine S2, β-caseine, κ-caseine, β-Lactoglobulin en BSA. Koemelk bestaat voor 3,01% uit eiwit. Het eiwit bestaat uit 20% wei en 80% caseine. Caseines (allergeennaam Bos d8) zijn een groep caseine-eiwitten: α-, β-, κ- en β-caseine. BSA (allergeennaam Bos d6) is een uniek eiwit dat niet behoort tot de caseinegroep. Zie tabel 2 voor het overzicht aan melkeiwitten. Op de LC-MSMS wordt naar alle eiwitten gekeken. Hierdoor is het mogelijk om in een monster onderscheid te maken tussen alle melkallergenen en geeft het inzicht in welk type melkproduct gebruikt is in een product. Bij ELISA’s is het dus niet duidelijk wat de fabrikant gebruikt heeft. Zijn het antistoffen tegen één soort caseïne en wordt de rest omgerekend? Door onderzoek weet Nutrilab dat ELISAfabrikanten doorgaans één antistof tegen β-lactoglobuline gebruiken en één antistof tegen een caseïne. Zij maken gebruik van de theoretische verhouding van caseïne en β-lactoglobuline in melk, namelijk 80% : 9%. Hieruit wordt het uiteindelijke melkgehalte berekend. Met LC-MSMS is altijd alles te berekenen door een totaaloptelling en dat geeft een zuiverder beeld.

Reageer op dit artikel